四、蛋白质的提取、分离和测定

 

从生物体提取蛋白质时,一般先用粉碎、切碎和均质的方法将细胞分裂开,然后用适当的溶剂进行提取,其它不溶于水的蛋白质也可以用稀碱液来提取。

将蛋白质提取物和残渣分离可用离心法或过滤法。将提取物中的蛋白质分离出来可用加有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮)或盐析法,盐析法在等电点时效果最好,盐析法使蛋白质沉淀中夹有大量无机盐,这些无机盐可以用透析等方法提纯。

蛋白质溶液具有许多高分子溶液的性质,如不能透过半透膜、扩散慢、粘度大等。将蛋白质溶液放在火棉胶薄膜中,浸入缓冲液中,这时水和小分子物质可以透过半透膜进入缓冲液中,而蛋白质则仍留在袋中,这样一来可将蛋白质与杂质分开。这种纯化法称为透析。其它半透膜材料有动物膀胱及玻璃纸等。

凝胶层析法的原理主要根据被分离物质的分子量不同,凝胶颗粒是多孔性的,它具有网络状的微孔。不同型号的凝胶网孔大小不同,并具有一定的最大极限和最小极限。当溶质分子直径比网孔直径还大时,它就被全部排斥在凝胶粒之外,小于网孔直径时,则全部能进入凝胶的网孔中,中等大小的分子在网孔内外有一定的分配系数,在洗脱时大分子最先流出,中等大小的分子次之,而小分子则最后流出来。

所谓的电泳就是带电的胶体颗粒核在电场中向相反的电极移动,其电泳的速度取决于胶体颗粒所带电荷的多少及分子颗粒的大小。

不同蛋白质其分子量不同,故其分子颗粒大小也不同,其次,不同蛋白质等电点不同,所以在一定的PH缓冲液中所带电荷的数目也不相同,因此在一定的PH溶液及一定的电场中,不同蛋白质电泳的速度和方向是不相同的,据此可分离并测定蛋白质的分子量分布。测定蛋白质含量的经典方法是凯氏定氮法。

凯氏定氮法原理

(1)消化:

  Ø样品中含氮有机化合物经浓硫酸加消化,硫酸使有机物脱水;          

    同时有机物炭化生成炭;

Ø炭将硫酸还原为SO2C则变为CO2

ØSO2使氮还原为氨,本身则氧化为SO3

Ø在反应过程中生成的氢,又加速氨的形成;

Ø生成物中水和SO2逸去,氨与硫酸结合生硫酸铵留在溶液中。

(2)蒸馏

硫酸胺在碱性条件下加热,释放出氨。

NH4 ++OH-    ----------      NH3+H2O    

 

(3)吸收与滴定

NH3  + H5BO3     -----------    NH4+ + H2BO3-

H2BO3-  + H+   -----------     H3BO3

蛋白质分子净电荷为零时的pH值定义为蛋白质的等电点pI。等电点pH不同于等离子点(isoionic point),等离子点是指不存在电解质时蛋白质溶液的pH值。  

表2-6  几种蛋白质的等电点(pI)

蛋白质

等电点

蛋白质

等电点

胃蛋白酶

1.0

血红蛋白

6.7

κ-酪蛋白B

4.1-4.5

α-糜蛋白酶

8.3

卵清蛋白

4.6

α-糜蛋白酶原

9.1

大豆球蛋白

4.6

核糖核酸酶

9.5

血清蛋白

4.7

细胞色素C

10.7

β-乳球蛋白

5.2

溶菌酶

11.0

β-酪蛋白A

5.3

 

 

大多数蛋白质是酸性蛋白,因此,它们在pH45(等电点)时的溶解度最低,而在碱性pH(一般 pH 89)时的溶解度最大。利用大多数蛋白质在pH89的高溶解性,提取植物蛋白。例如将大豆粉置于pH89的碱性水溶液中浸提,然后利用等电点沉淀法将pH调至4.5~4.8,再从提取液中回收大豆蛋白。  

除了从植物中提取蛋白质外,还可利用微生物发酵进行蛋白质工业化生产,如用淀粉、制糖工业的糖蜜等作发酵底物,可获取单细胞蛋白。

五、蛋白质的分类

天然存在的蛋白质种类繁多,结构复杂,可根据其在水或其它溶剂中的溶解度以及蛋白质盐析沉淀时所需盐的浓度来加以分类。

 

 

 

 

 

 

 

    

   另外一种分类法是根据蛋白质的分子组成来分,可分两类,一类是分子中仅含有氨基酸(即细胞中未被酶修饰的蛋白质)的简单蛋白(Homoproteins),另一类是由氨基酸和其他非蛋白质化合物组成(即经酶修饰的蛋白质)的结合蛋白(Conjugated proteins),又称杂蛋白(Heteroproteins)。结合蛋白中的非蛋白质组分统称为辅基(Prosthetic groups)。根据辅基的化学性质不同,可以分为核蛋白(核糖体和病毒)、脂蛋白(蛋黄蛋白、一些血浆蛋白)、糖蛋白(卵清蛋白、κ-酪蛋白)、磷蛋白(α-和β-酪蛋白、激酶、磷酸化酶)和金属蛋白(血红蛋白、肌红蛋白和几种酶)。其中糖蛋白和磷蛋白是蛋白质以共价键分别与碳水化合物和磷酸基团连接,而其他的蛋白质则是蛋白质通过非共价键与核酸、脂类和金属离子形成复合物。

     每一种蛋白质都有其特定的三维结构。因此也可按照蛋白质的结构分为纤维蛋白和球蛋白。纤维蛋白是由线形多肽链组成,构成生物组织的纤维部分,如胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和原肌球蛋白都属于这类蛋白质。球蛋白是一条或几条多肽链靠自身折叠而形成球形或椭圆结构。此外,肌动蛋白和血纤维蛋白等纤维蛋白分子是为α-球蛋白的线性聚集结构。大多数酶都属于球蛋白,纤维蛋白总是起着结构蛋白的作用。

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